Utilidad de la PCR en la detección de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas

Sebastian Iglesias Osores; Charles Ruiz Torres; Giancarlo Becerra Atoche

Artículo original

Utilidad de la PCR en la detección de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas

Usefulness of PCR in the detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples

Sebastian Iglesias Osores^1* https://orcid.org/0000-0002-4984-4656

Charles Ruiz Torres² https://orcid.org/0000-0001-6052-543X

Giancarlo Becerra Atoche³ https://orcid.org/0000-0001-9412-2137

¹Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Lambayeque, Perú.

²Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Señor de Sipán. Chiclayo, Perú.

³Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Cesar Vallejo. Piura, Perú.

*Autor para correspondencia. Correo electrónico: sebasiglo@gmail.com, siglesias@unprg.edu.pe

RESUMEN

Introducción: La tuberculosis es una enfermedad infecciosa altamente prevalente en todo el mundo.

Objetivo: Determinar la utilidad diagnóstica de M. tuberculosis por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en pacientes de un hospital del norte de Perú.

Métodos: Las muestras clínicas de los pacientes se procesaron para la extracción de ADN por el método salting out. Para determinar si el patógeno la muestra de esputo pertenece al complejo M. tuberculosis se emplearon los marcadores que amplifican IS6110, se amplificó usando la técnica PCR y luego los productos de PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y visualizados mediante tinción con bromuro de etidio al 1%. El estudio se realizó en el Hospital Regional Lambayeque, Chiclayo, Lambayeque, Perú.

Resultados: Se evaluaron 148 muestras de pacientes: 72 (48%) varones y 77 (52%) mujeres. Las edades fluctuaron desde los cinco a los noventa y tres años, con una media de 45,85 años. Se observó que 105 (70%) pacientes resultaron negativos para la prueba de tuberculosis y 44 (30%) positivo. Se detectaron además 24 (55%) pacientes varones que fueron positivos y 20 (45%) pacientes mujeres que fueron negativas. En las muestras que resultaron positivo para TBC se encontraron: 2 (5%) biopsia de absceso, 2 (5%) biopsia de intestino, 17 (39%) lavado bronqueo alveolar, 4 (9%) líquido cefalorraquídeo, 17 (39%) líquido pleural y 2 (5%) líquido peritoneal.

Conclusiones: Se puede detectar Mycobacterium tuberculosis en muestras pulmonares y extra pulmonares en pacientes hospitalarios.

Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis pulmonar, reacción en cadena de la polimerasa, PCR

ABSTRACT

Introduction: Tuberculosis is a highly prevalent infectious disease worldwide.

Objective: To determine the diagnostic usefulness of M. tuberculosis by polymerase chain reaction technique (PCR) in patients from a hospital at northern Peru.

Methods: Clinical samples from patients were processed for DNA extraction by the salting out method. To determine if the pathogen in the sputum sample belongs to the M. tuberculosis complex, markers that amplify IS6110 were used, amplified using the PCR technique and then the PCR products were subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis and visualized by staining with 1% ethidium bromide. The study was conducted at the Hospital Regional Lambayeque, Chiclayo, Lambayeque, Peru.

Results: A total of 148 patient samples were evaluated: 72 (48%) males and 77 (52%) females. Ages ranged from five to ninety-three years old, with an average age of 45.85 years old. It was observed that 105 (70%) patients tested negative for tuberculosis and 44 (30%) tested positive for tuberculosis. In addition, 24 (55%) positive male patients were detected as well as 20 (45%) negative female patients. In the samples that tested positive for TB, two abscess biopsy (5%), two intestinal biopsy (5%), seventeen bronchoalveolar lavage (39%), four cerebrospinal fluid (9%), seventeen pleural fluid (39%) and two peritoneal fluid (5%) were found.

Conclusions: Mycobacterium tuberculosis can be detected in pulmonary and extrapulmonary samples in hospital patients.

Keywords: Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, pulmonary, polymerase chain reaction, PCR

Recibido: 22/02/2022.

Aprobado: 31/03/2022.

Introducción

La tuberculosis (TB) sigue siendo una de las principales enfermedades infecciosas en todo el mundo y sobre todo en países en desarrollo, causada por Mycobacterium tuberculosis.⁽¹⁾ En 2018, alrededor de 1,5 millones de personas en todo el mundo murieron de tuberculosis y se estima que 1700 millones de personas en todo el mundo están infectadas durante el periodo de incubación sin ningún síntoma evidente.⁽²⁾

La TB daña principalmente los pulmones, causando la tuberculosis pulmonar, pero también puede dañar otros órganos, causando tuberculosis ósea, tuberculosis nerviosa, tuberculosis cutánea, tuberculosis renal y otras infecciones.^(2,3)

El diagnóstico de TBEP es difícil debido a la naturaleza paucibacilar de las muestras, la falta de volúmenes de muestras clínicas adecuadas, la distribución no uniforme de bacterias en esas muestras y la localización de la enfermedad en sitios de difícil acceso que con frecuencia se asemeja a otras enfermedades.^(4,5,6) La TBEP representa del 5–20% de todos los casos de TB.⁽⁵⁾

El uso generalizado de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción de ADN (RFLP) para diferenciar cepas de Mycobacterium tuberculosis para detectar tuberculosis se ha visto obstaculizado por la necesidad de cultivar este organismo de crecimiento lento y por el nivel de sofisticación técnica necesaria para la tipificación de RFLP.⁽⁷⁾ El problema central en la demora del diagnóstico y el tratamiento es común por falta de diagnóstico específico.⁽⁸⁾

En la década de 1980, después de una disminución constante durante las décadas anteriores, hubo un resurgimiento en la tasa de tuberculosis en los Estados Unidos que coincidió con la epidemia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida.⁽⁹⁾

Los patrones de enfermedad desde entonces han cambiado, con una mayor incidencia de enfermedad diseminada y extrapulmonar ahora encontrada. Los sitios de infección extrapulmonar comúnmente incluyen ganglios linfáticos, pleura y áreas osteoarticulares, aunque cualquier órgano puede estar involucrado.^(5,10)

El diagnóstico de TBEP puede ser difícil de alcanzar, lo que requiere un alto índice de sospecha en los pacientes. El diagnóstico definitivo y rápido es un desafío, ya que las técnicas convencionales tienen limitaciones.⁽⁴⁾ Por tanto, la presente investigación busca determinar los casos de M. tuberculosis por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en pacientes de un hospital del norte de Perú.

Método

Población y muestra de estudio

Estudio retrospectivo de corte transversal, se evaluaron muestras de pacientes con sospecha de tuberculosis pulmonar y no pulmonar del año 2015 al 2019 de los servicios de oncología, neumología, ginecología, dermatología, gastroenterología, neurología y pediatría, las muestras fueron diversas (líquido cefalorraquídeo o LCR, líquido pleura, biopsias, líquido ascítico), los pacientes fueron derivados para estudios complementarios de distintos servicios médicos, el estudio contó con la aprobación del comité de ética del Hospital Regional Lambayeque, Chiclayo, Lambayeque, Perú.

Identificación del complejo Micobacterium tuberculosis mediante PCR

Las muestras clínicas de los pacientes serán procesadas para la extracción de ADN por el método salting out. Para determinar si el patógeno de la muestra de esputo pertenece al complejo M. tuberculosis se emplearon los marcadores que amplifican IS6110, las amplificaciones se realizaran bajo las siguientes condiciones 1,5 mM de MgCl₂, 0,2 mM de mezcla de dNTPs; 1,2 uM de cada primer y 1U de enzima Taq ADN polimerasa. Las condiciones en el termociclador serán las siguientes: 95 °C por 10 min, 40 ciclos de 95 °C durante 1 min, 64 °C por 1 min y 72 °C por 2 min, con una extensión final de 72 °C por 7 min.

Luego los productos de PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y visualizados mediante tinción con bromuro de etidio al 1%. Se empleó el fotodocumentador Pharos Fx para digitalizar la imagen en conjunto con el software Quantity One para determinar el peso molecular de los productos de amplificación. El marcador IS6110 F 5´ CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG y IS6110 R 5´CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG el que permite la amplificación de 123 bp⁽¹¹⁾ bajo las condiciones, temperatura de denaturación 94˚C, 68˚C, and 72˚C 1 min cada número de ciclos. Además se hizo una amplificación con un fragmento de 268 pb del gen de la beta-globina humana para demostrar la presencia de ADN idóneo.⁽¹²⁾

Procesamiento de datos y análisis estadístico

Para la recolección de la información se elaboró una base de datos en Microsoft Excel. Las variables cualitativas se describirán con frecuencias absolutas y relativas, con el paquete estadístico Infostat 2018. Se aceptó como significativa toda p menor de 0,05.

Resultados

Se evaluaron las muestras de 72 (48%) pacientes varones y 77 (52%) pacientes mujeres. Las edades van desde los cinco años a los noventa y tres con una media de 45,85 años (DE 8,7). Se observó que 105 (70%) pacientes fueron negativos y 44 (30%) positivos para la prueba de tuberculosis. Detectamos además 24 (55%) pacientes varones que fueron positivos y 20 (45%) mujeres que fueron negativos.

Tabla I. Tipo de muestras que se usaron para la detección molecular de tuberculosis

Discusión

En la actualidad, el diagnóstico rápido de tuberculosis pulmonar se basa en la microscopía. Sin embargo, esta técnica es insensible y muchos casos no pueden confirmarse inicialmente.⁽¹³⁾ Las técnicas de amplificación de ácido nucleico son extremadamente sensibles, pero cuando se aplican al diagnóstico de tuberculosis, han dado resultados variables. Con tuberculosis con muestras con cultivo negativo y con baciloscopia positiva se puede diagnosticar en el momento del ingreso, y potencialmente todos los pacientes con muestras con baciloscopia positiva se pueden confirmar inmediatamente como infectados con M. tuberculosis, que conduce a una mejor gestión clínica.⁽¹⁴⁾

Los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis contienen el elemento transponible IS6110 que, debido a su alto polimorfismo numérico y posicional, se ha convertido en un marcador ampliamente utilizado en estudios epidemiológicos.⁽¹⁵⁾

La especificidad de IS6110 para el complejo Mycobacterium tuberculosis.⁽¹⁶⁾ En nuestro estudio se ha detectado el complejo Mycobacterium tuberculosis en muestras de biopsia de absceso que pueden detectarse en abscesos fríos tuberculosos o gomas son inusuales y producto de la diseminación hematógena de micobacterias.⁽¹⁷⁾ Esta forma de tuberculosis es muy inusual.

En este estudio se detectó Mycobacterium tuberculosis en biopsia de intestino que puede estar relacionada con una tuberculosis rectal que simula un cáncer de recto,⁽¹⁸⁾ las muestras de lavado bronqueo alveolar son muestras donde se puede detectar con facilidad a Mycobacterium tuberculosis. ⁽¹⁹⁾

En este trabajo se usó un método de PCR para el diagnóstico rápido y preciso de meningitis tuberculosa (TBM) en muestras de LCR.⁽²⁰⁾

Los fluidos en los que rara vez se encuentra Mycobacterium tuberculosis, como los líquidos pleurales y cerebroespinales, son buenos candidatos para ser estudiados utilizando técnicas de PCR.

La alta especificidad del fragmento MPB64 a la vez que conserva una buena sensibilidad lo hace muy adecuado para el diagnóstico de tuberculosis pleural y cerebroespinal.⁽²¹⁾

El diagnóstico de la tuberculosis pleural usualmente presenta la dificultad característica de demostrar la infección por Mycobacterium tuberculosis mediante confirmación directa en tinciones y cultivos, lo que ha impulsado el establecimiento de nuevos criterios y el desarrollo de intervenciones dirigidas a mejorar la sensibilidad de los métodos diagnósticos. Se reporta el caso de un paciente con derrame pleural unilateral cuya presentación clínica satisface los criterios diagnósticos de tal condición⁽²²⁾ y en el caso del líquido peritoneal siendo esta una forma de tuberculosis donde se observa la presencia de granulomas necrotizantes de Mycobacterium tuberculosis en líquido ascítico.⁽²³⁾

Otros estudios muestran los bajos rendimientos por frotis y cultivo se atribuyen a la carga paucibacilar en los especímenes. La mayor sensibilidad en la PCR se logró con IS6110; los valores de sensibilidad y especificidad fueron 83 y 93,8%, 87,5% y 100%, y 66,7% y 75%, respectivamente, en muestras de líquido pleural, tejido pleural biopsiado con aguja y ganglios linfáticos.⁽⁴⁾

Es importante señalar que la validez de los resultados de la PCR en estudios clínicos depende del uso de controles de contaminación paralelos a todos los pasos de la PCR y la simplicidad del método de extracción de ADN, así como de la especificidad de los resultados de la PCR.⁽²⁴⁾ Las técnicas de diagnóstico basadas en PCR tienen dos problemas principales: reacciones falsas positivas debido a la contaminación con fragmentos de ADN de PCR anteriores (amplicones) y reacciones falsas negativas causadas por inhibidores que interfieren con la PCR.⁽²⁵⁾

Una de las limitaciones del estudio es contar con un pequeño tamaño de muestra, se contó además con un resultado desconocido por baciloscopia al momento de realizar el estudio, se recomienda hacer una comparativa de PCR y cultivo bacteriano. Los resultados obtenidos por PCR fueron consistentes con los obtenidos con cultivo, que es el "estándar de oro" demostrando que la PCR es una técnica útil para el diagnóstico rápido de tuberculosis en varios sitios.⁽²⁵⁾

Conclusiones

Se puede detectar Mycobacterium tuberculosis en muestras pulmonares y extrapulmonares de pacientes hospitalizados.

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